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胃癌組織型の多様性を生じる分子メカニズムの解析

胃癌の多くがピロリ菌持続感染に伴う萎縮性胃炎・腸上皮化生を背景に出現することは既に確立された概念となっていますが、前癌病変とされる萎縮性・化生性胃炎から胃腺腫や胃癌が生じる機構は現在も解明されていません。特に、胃癌の大きな特徴である組織型の多様性は、浸潤能・転移能や患者の予後・治療選択に直結し、悪性度を規定する極めて重要な因子ですが、その多様性の分子基盤は、全く未解明のままとなっています。

我々は発癌の分子機構を特に分化とエピジェネティクスの視点から追求し、特に胃癌研究においては、(a) クロマチン構造変換因子SWI/SNFの必須構成因子Brmが様々な悪性腫瘍で欠失しており、癌抑制遺伝子として機能すること(Oncogene 24:5471,2005)、(b) Brmが特に胃癌において高頻度に欠失し、その発現が胃癌組織型と明らかに関連していること(図A、Cancer Res 67:10727,2007)、(c) 消化管分化の必須転写因子Cdx2がBrm型SWI/SNF複合体と共役し、腸分化マーカーvillinの発現を制御すること(図B, 図C、Exp Cell Res 315:1779,2009)、(d) Brmの発現欠失は可逆的であり、次世代の抗癌剤と期待されるHDAC(ヒストン脱アセチル化)阻害剤処理によって発現回復すること(Oncogene 24:5471,2005/J Biol Chem 2278:7422,2003)を、発見・報告してきました。

これまでの研究成果を踏まえ、現在、『本来は慢性炎症に対する防御機構である腸上皮化生の過程において、エピジェネティカルなメカニズムの破綻(Brmの発現低下~欠失によるSWI/SNF複合体の機能異常など)によって、Cdx2に代表される共役する腸分化制御遺伝子の発現調節異常が生じ、結果として「腸への分化の破綻」が引き起こされ、胃癌の悪性度上昇や組織分化度の低下に繋がる』というモデルを提唱しています(図D)。

「腸分化(腸形質への分化)」の進展・維持・破綻に関しては分子基盤が少しずつ明らかとなってきていますが、それでも未解明な部分は非常に多く、「胃分化(胃形質への分化)」の維持がどのように制御され、その失調~破綻がどのような機序で生じるかに関しては、殆ど解明されていません。胃癌の発症、ならびに、その多様な組織型が生じる原因の究明には、「消化管分化」の制御と破綻の分子メカニズムに迫ることが必須であると考えています。
 
早期消化管癌の臨床検体が豊富に得られる環境の中で、様々な分子生物学的・生化学的手法や病理学的手法を組み合わせることにより、胃癌の発症機構、および、その組織型の多様性に迫れないかと、努力を続けています。

(山道信毅、高橋悠、中山千恵美)
【図A】クロマチン構造変換因子SWI/SNF複合体のATPse活性を担う構成因子Brmの発現欠失と胃癌組織型との関連
【図B】 腸分化マーカーvillinの発現制御におけるSWI/SNF複合体(Brm型)とCdxとの相互作用
【図C】 腸分化マーカーvillinと腸分化のキー分子(転写因子)Cdx2の発現の相関
【図D】 腸上皮化生・SW/SNF複合体とCdxの相互作用から想定される胃癌組織型と腸分化との関連

腸分化誘導による胃癌抑制の可能性の追求

胃癌の背景粘膜に腸上皮化生も多く観察されることから、腸上皮化生は前癌病変あるいは傍癌病変として注目されてきました。腸上皮化生は「胃粘膜上皮細胞が腸管粘膜上皮細胞の形態に変化する現象」であり、炎症粘膜の再生過程に生じることが知られていますが、形態学的あるいは免疫組織学的におおきく2種類に分類されています(完全型≒腸型と不完全型≒胃腸混合型)。

腸上皮化生の進行・広がりとともに胃癌の発症頻度が高くなると考えられている一方で、完全型(≒腸型)腸上皮化生の組織構築は、不完全型(=胃腸混合型)よりも明らかに整っており、むしろ、随伴して生じる胃上皮性腫瘍の悪性度は低いという考え方が、以前より根強くあります。「
悪性度が低い胃腺腫は胃癌に比べて明らかに腸型分化マーカーの発現が強く、胃型分化マーカーの発現が弱い」という我々自身の先行研究(PLoS One. 2013;8(2):e56766)の結果も踏まえ、胃癌は「胃への分化」と「腸への分化」が不安定な状態の粘膜から好発するという仮説に立って、様々な実験を行なっています。

何らかの遺伝子導入、あるいは、薬剤刺激による腸型形質への強制的な分化誘導が、胃癌のoncogenic potentialを変えるのではないかという夢を追って、分子生物学・生化学・病理学・内視鏡学など様々な概念と手法を組み合わせながら、一歩一歩、研究を行なっています。
 
(中山千恵美、山道信毅)

不完全型(胃腸混合型)腸上皮化生
完全型(腸型)腸上皮化生

萎縮性胃炎→腸上皮化生→胃癌と進行する胃癌発生の経路の解析

この研究に関して、以下のような免疫染色を行なっています。
 
(山道信毅)


消化器内科の外来受診あるいは入院診療をうけられた患者さんへ
研究課題名:「胃癌関連マーカーならびに消化管分化マーカーの免疫染色による発現解析の検討(後ろ向き解析)」研究への協力のお願い

 

東大病院消化器内科では、様々な成因で起こってくる胃癌や大腸癌、食道癌などの発生機序につき、様々な観点から研究を行ってきました。特に胃癌はその組織型が、病変の浸潤・転移などの進行度合いとともに治療方針に大きく影響しますので、患者さんの治療方法を決めるにあたり、それらの解析は非常に重要な要因となります。しかしながら、その胃癌の組織型決定の詳細は殆ど解明されておらず、組織型の判定に関して有用な目印(マーカー)や浸潤転移の指標となる目印の検索が医学上の大切な課題です。このことにより、診断治療への応用が期待されます。また、他の消化管癌(食道、大腸、小腸)に関しましても、その成り立ちを検索するために指標となりえる目印を特定し、癌の発生機序に関して深く追求することが、病気への理解、ひいては、診断治療に繋がるものと考えられます。

そこで、東大病院消化器内科を受診されました患者さんの以前のデータを解析することといたしました。対象となるデータは、患者さんの診断名、検査結果(血液検査)、内視鏡所見、内視鏡によって得られた生検の病理標本、内視鏡治療によって得られた治療後の病理標本を対象といたします。病理組織標本に関しては、消化管全般の組織で検索を施行するため、食道、胃、大腸、小腸の標本を使用します。

この研究は、過去の診療記録を用いて行われますので、該当する方の現在・未来の診療内容には全く影響を与えませんし、不利益を受けることもありません。解析にあたっては、個人情報を匿名化させていただき、その保護には十分配慮いたします。当然ながら、学会や論文などに使用される結果発表に際しては、個人の特定が可能な情報はすべて削除されます。

この研究に関して、不明な点がある場合、あるいはデータの使用に同意されない場合には、以下にご連絡頂きたいと思います。なお、本研究は、当院の倫理委員会の承認を得ております。

この研究への参加をお断りになった場合にも、将来的に当科における診療・治療の面で不利益をこうむることはありませんので、ご安心ください。

 

 

平成 23年 12月 11日
連絡先 東京大学医学部附属病院 消化器内科 山道信毅
住所:113-8655  東京都文京区本郷7-3-1
電話:03-3815-5411(内線 36818

  

消化管分化マーカー遺伝子の発現制御解析と臨床応用

胃癌の多くは、「胃分化」と「腸分化」が不安定な状態にある「腸上皮化生」を背景に生じてきます。消化管癌で胃癌と並んで高頻度に生じる大腸癌では、これとは逆に、しばしば、胃の分化マーカーが異常発現することも報告されています。消化管癌がこうした分化異常を背景に生じる可能性に着目し、様々な胃型形質マーカー遺伝子・腸分化マーカー遺伝子の発現制御を解明することによって、「分化」という観点から、消化管癌の発症機構、ならびに、その組織型の決定機構の解明を目指しています。

現在、我々は下記のような分子生物学的手法を用いて、消化管分化に関与する遺伝子の同定、ならびに、その分子メカニズムの解明を目指しています。

◇ 遺伝子発現ベクターを用いた一時的な遺伝子過剰発現
◇ レトロウイルス発現システムを用いた遺伝子過剰発現
◇ siRNAによる遺伝子ノックダウン
◇ レンチウイルス発現システムを用いたshRNAによる遺伝子ノックダウン
◇ 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によるmRNA量の比較
◇ ウエスタン解析や免疫染色によるタンパク質量の比較
◇ デュアル-ルシフェラーゼ定量システムを用いたプロモーター解析
◇ クロマチン免疫沈降法によるDNA結合タンパク質とゲノムDNAの相互作用の解析
◇ FACSを用いた細胞周期解析

これまでに胃腺窩上皮マーカー遺伝子MUC5AC、腸分化マーカー遺伝子villin1の発現制御解析を行ない、報告しています。


【文献】
Gli Regulates MUC5AC Transcription in Human Gastrointestinal Cells.  
Kageyama-Yahara N, Yamamichi N, Takahashi Y, Nakayama C, Shiogama K, Inada K, Konno-Shimizu M, Kodashima S, Fujishiro M, Tsutsumi Y, Ichinose M, Koike K.
PLoS One. 2014 Aug 28;9(8):e106106. 

Cdx2 and the Brm-type SWI/SNF complex cooperatively regulate villin expression in gastrointestinal cells.
Yamamichi N, Inada K, Furukawa C, Sakurai K, Tando T, Ishizaka A, Haraguchi T, Mizutani T, Fujishiro M, Shimomura R, Oka M, Ichinose M, Tsutsumi Y, Omata M, Iba H.
Exp Cell Res. 2009 Jun 10;315(10):1779-89.

(影山夏子、山道信毅) 
 
GliによるMUC5ACの発現制御の諸解析
Luciferase assayによるMUC5ACプロモーター領域のGli結合領域の同定

胃粘膜メチル化の検証によるESD施行後異時性多発胃癌発生予測に対する前向き多施設共同研究

メチル化はエピジェネティクスの代表的な分子メカニズムの1つですが、発生・分化などの正常な生命現象に必須である一方、その制御異常が多くの疾患・病態(特に悪性腫瘍)と関与していることが報告されています。
 
「胃粘膜に蓄積したDNAメチル化異常の程度と胃癌発症リスクがよく相関する」というこれまでの研究成果を踏まえ、2008年より国立がんセンター・東大消化器内科などが中心となって、「ESD後の胃癌患者について、除菌後の非癌部胃粘膜のDNAメチル化レベルの測定が、異時性多発胃癌の発生予測に有用であるか否かを明らかにする研究」に取り組みました。これまでの研究の蓄積から、我々は3遺伝子 (miR-124a-3、EMX1、NKX6-1)のDNAメチル化レベルに注目して、多施設共同前向き研究を開始しました。
 
40-80歳の早期胃癌患者でESD施行症例782例(追跡期間中央値2.97年)を3年間追跡したところ、66例に追跡開始後1年以上を経て、異時性多発胃癌が発生しました。特にmiR-124a-3のメチル化レベルが高い症例は低い症例に比べて有意に異時性多発胃癌発生のリスクが高い結果が得られ(ハザード比2.3、95%信頼区間1.0-5.1、P=0.042)、EMX1・NKX6-1についても同様の傾向が認められました。この結果は、追跡開始後1年未満の胃癌を含む81例の解析でも同様でした。
 
ピロリ菌除菌後であっても、一定の頻度で異時性多発胃癌が発生することは良く知られていますが、今回の解析結果は胃粘膜DNAメチル化レベルの測定による発癌リスク診断の有用性を示した重要な結果であり(右のシェーマ参照)、臨床・基礎の融合した大きな成果として、国際的な評価を獲得しています(文献参照)。
 
今回、示された「異時性多発胃癌の予測における有用性」をもとに、「健常者の将来的な胃癌発症予測にも応用できるか」というテーマに向けて、現在は新しい取り組みを開始しています。
 
(山道信毅、藤城光弘、国立がんセンター)
 
【文献】
Demonstration of the usefulness of epigenetic cancer risk prediction by a multicentre prospective cohort study.
Asada K, Nakajima T, Shimazu T, Yamamichi N, Maekita T, Yokoi C, Oda I, Ando T, Yoshida T, Nanjo S, Fujishiro M, Gotoda T, Ichinose M, Ushijima T.
Gut. 2014 Jun 2. pii: gutjnl-2014-307094. doi: 10.1136/gutjnl-2014-307094.
 
胃粘膜のメチル化レベルと胃癌リスクの関連

十二指腸腫瘍性病変の網羅的な遺伝子発現解析

乳頭部腫瘍を除く原発性十二指腸腫瘍は、発生頻度0.02~0.5%、消化管悪性腫瘍全体の約0.5%と言われる、比較的稀な疾患です。しかしながら、昨今、内視鏡検査の普及とともに十二指腸腺腫及び早期十二指腸癌の発見が増えつつあり、その明確な診断・治療基準が定まっていないことが、臨床上の大きな課題となっています。

そこで我々は、これまで報告のない「十二指腸腫瘍に対する網羅的な遺伝子解析」を試みることにしました。十二指腸腫瘍の遺伝子発現解析を行なうことにより、十二指腸腫瘍特異的なマーカー遺伝子の同定を第一の目標とし、これをもとに、十二指腸腫瘍の発生機序解明、その病理学的な鑑別への応用、さらには有効な化学療法の予測を目指すことが本研究の最終目標です。

当院において内視鏡的及び病理学的に、十二指腸腺腫または早期十二指腸癌の診断に至った症例で研究同意がえられた症例を対象に、十二指腸腫瘍及び周囲背景正常粘膜よりそれぞれ通常生検鉗子(径2.8mm)による内視鏡下生検を行ない、組織検体を採取します。この採取組織より全RNA抽出を行ない、mRNA microarray・miRNA microarrayによる遺伝子発現解析を行ないます。2013年より継続して治療・本研究を行なっておりますので、十二指腸腺腫・早期十二指腸癌の患者さんがおりましたら、積極的にご紹介いただけますようお願いいたします。

<研究対象>
○選択基準:十二指腸腺腫または早期十二指腸癌のいずれかの症例。
○除外基準:乳頭部癌、胃や食道に対する外科的切除の既往、重複悪性疾患、家族性大腸腺腫症、ガードナー症候群、炎症性腸疾患、最終病理学的評価で進行十二指腸癌、特に倫理的な配慮を必要とする未成年者・高齢者・障害者、抗血小板薬内服中

1回の生検(約10mg)から、マイクロアレイに十分な精度の全RNAが3~10μg得られており、実際のクラスタリングも問題なく可能な結果が得られています(図1)。現在、バイオインフォマティクスの専門家である冨田秀太准教授(岡山大学)との週1回のWEBカンファレンス(図2)を通じて、解析を進めています。

(坂口賀基、山道信毅、高橋悠、竹内千尋)
【図1】 十二指腸腺腫・癌の腫瘍部・周辺非腫瘍部で発現する遺伝子のクラスタリング
【図2】 スカイプによるWEBカンファレンス

細胞間接着・細胞極性に根差した消化器癌の発症機構・悪性度の解明

癌は一般に病理学的に構造異型と細胞異型を評価することにより診断されます。細胞の集合として組織が成り立っていることから、組織の構造としての異常である構造異型は、細胞の形態異常や細胞間接着の異常と関連しているのではないかと考えることができます。実際に、細胞接着因子の一つであるE-cadherinの異常は胃癌と深い関連があることがよく知られていますが(Nature 392, 402-405:1998)、これは細胞間接着が癌と密接に関連することを示す1つの例と言えるでしょう。

 

細胞間接着においては、① Tight junction、② Adherens junction、③Desmosomeが大きな役割を果たしています。Tight junctionは近年、4回膜貫通タンパクであるclaudinを中心に癌との関連についての報告が増えており、胃においては臓器特異的に発現するclaudin 18を中心に、claudinファミリーと腸上皮化生や胃癌との関連が報告されています(Cancer Sci 98(7), 1014-1019:2007, J Histochem Cytochem 57(8), 775-785:2009)Adherens junctionでは cadherin-catenin がよく研究されており、上記のようにE-cadherin と癌の関連については特に有名です。またnectin-afadinからなる接着と癌の関連については、nectin 4が乳癌・卵巣癌・肺癌で異常発現すること(Oncogenesis3, e118:2014, Am J Clin Pathol 134, 835-845:2010, Cancer Res 69, 6694-6703:2009)afadinの減少が乳癌・大腸癌の予後と関連があること(Int J Cancer 131,E236-243:2012, Biochim Biophys Acta 1843(3), 618-628:2014)などの報告があります。Desmosomeについては尋常性天疱瘡など皮膚疾患との関連について有名ですが、Desmosome関連タンパクの発現欠失により癌の転移や予後が悪化することが報告されています(Nat Rev Cancer 11(5), 317-323:2011) 
 

我々はさらに細胞極性にも注目しています。細胞極性は細胞異型と密接に関連していると想定され、上記の細胞間接着因子と細胞極性因子の間にも、様々な関連があることが知られています(Nat Rev Cancer 12(1), 23-38:2011)。これらの細胞間接着因子・細胞極性因子と癌の関連について、病理学・分子生物学・内視鏡学などのミクロ・マクロの手法を組み合わせた集学的アプローチによる解明を、様々な研究機関との共同研究を通じて目指しています。

(高橋悠) 

   

当科では「細胞接着因子の消化管臓器における発現の病理組織学的検討」の研究を行っております。 

【研究の目的】

当科では、胃癌や大腸癌などの消化管癌の内視鏡的治療を行っております。治療の前には癌の正確な範囲を認識する必要があり、現在では高い精度で内視鏡的に診断可能となってきています。一方で癌の範囲を認識できない症例もあり、また癌部・非癌部の見た目の違いを生む原因についても十分に解明されていません。見た目の違いの原因として、細胞同士の結びつき方に変化が起こっていることがあるのではないかと考え、非癌部、癌部の間での細胞の結びつき方に関連するタンパクの発現に差があるかどうかを検証することを目的としています。

 

研究期間:本審査の承諾日〜5年間(予定)

 

【対象となる方】

東京大学医学部附属病院消化器内科で200511日以降に行われた内視鏡下生検・内視鏡的粘膜切除術(EMR)・内視鏡的粘膜下層剥離術(ESD)を施行された方。

既に得られている資料を用いての研究ですので研究対象者に新たに侵襲や費用が発生することはありません。

 

【研究の方法】

この研究は東京大学医学部倫理委員会の承認のうえ実施されます。以前に受けられた内視鏡的切除検体を使用して行う研究です。必要となる個人情報は、病理標本(生検、内視鏡的粘膜切除術、内視鏡的粘膜下層剥離術にて得られた検体)、病理所見、内視鏡所見、症例の基本情報(診断、年齢、性別、身長、体重、血液データ)です。個人情報は厳重な管理のもと研究終了後5年間保存されます。研究対象となることを希望されない場合や、お聞きになりたいことがある場合には下記までご連絡下さい。本審査の承認日より1年以内にご連絡をいただかなかった場合にはご了承をいただいたものとさせていただきます。また、研究対象となることを希望されない場合には下記「同意撤回書」をダウンロードしていただきご郵送いただくことも可能です。

 

研究結果は個人が特定できない形式で学会等で発表されます。なお、全ての解析が終了後の成果については、お問い合わせがあれば全体の結果に関して開示します。下記までご連絡ください。

 

【連絡先】

          東京大学医学部附属病院消化器内科 高橋悠

          住所:東京都文京区本郷7-3-1

電話 03-3815-5411

              Eメールでのお問い合わせ yutakahashi-tky[アットマーク@に変えてください]umin.ac.jp

 

消化管分化の観点からみた十二指腸上皮性腫瘍の病理学的な解析

十二指腸は胃と小腸を結ぶ約25cmの短い腸管ですが、発生学的に前腸と中腸の両者に由来し、胆汁・膵液が大十二指腸乳頭(ファーター乳頭)から注ぐ、特殊な臓器です。乳頭部腫瘍を除く原発性の十二指腸腫瘍は稀とされてきましたが、近年、内視鏡検査の普及とその技術の向上に伴い、十二指腸原発の癌・腺腫の報告は増加傾向にあると考えられています(Cancer Epidemiol 2012;36:e158-63)。しかしながら、症例蓄積が困難であり、大規模な解析は行われておらず、内視鏡的にも病理学的にも明確な診断基準が確立されていません。こうした病態評価の困難さに加えて、解剖学的要因や胆汁・膵液への持続的な曝露などが重なり、内視鏡治療・外科治療の難易度も高く、臨床的対応に苦慮する疾患です。

こうした背景を踏まえ、我々は現在、内視鏡的に切除された十二指腸原発の早期癌・腺腫症例の臨床的・免疫組織学的特徴を評価し、その病態を明らかにすることを目標に、臨床研究を進めています。現在、当院ならびに関連施設における約70症例の内視鏡治療切除検体の症例蓄積が得られ、その成果を学会報告していますが、さらなる内視鏡治療症例の蓄積を継続するとともに、外科切除された進行十二指腸癌への解析の展開を目指しています。

(皆月ちひろ)


消化器内科の外来受診あるいは入院診療をうけられた患者さんへ
研究課題名:「十二指腸腫瘍性病変の消化管分子マーカーによる免疫組織学的検討(多施設共同研究)」研究への協力のお願い

東大病院消化器内科では、胃・食道・大腸などの消化管癌の発生機序につき、様々な観点から研究を行ってきました。現在、上部消化管内視鏡検査は広く普及し、上部消化管疾患の診断の性能は格段に上がっています。その中で、十二指腸に発生する腫瘍は極めて稀な疾患と言われています。十二指腸腫瘍の診断、治療の指針は決まっていないため、大腸癌の診断指針に沿って診断したり、胃の腫瘍性病変に準じて治療を行ったりしているのが現状であり、臨床的特徴の報告も不十分と言わざるを得ません。十二指腸腫瘍における病態の把握や、診断学の確立が医学上の大切な課題です。十二指腸腫瘍の病理学的・臨床的特徴の理解が深まることで、今後、より正確な診断や効果的な治療に繋がるものと考えられます。

そこで、東大病院消化器内科を受診されました患者さんの以前のデータを解析することといたしました。対象となるデータは、患者さんの診断名、検査結果(血液検査)、内視鏡所見、内視鏡によって得られた生検の病理標本、内視鏡治療によって得られた治療後の病理標本を対象といたします。病理組織標本に関しては、十二指腸の組織で検索を施行するため、十二指腸の標本を使用します。

この研究は、過去の診療記録を用いて行われますので、該当する方の現在・未来の診療内容には全く影響を与えませんし、不利益を受けることもありません。解析にあたっては、個人情報を匿名化させていただき、その保護には十分配慮いたします。当然ながら、学会や論文などに使用される結果発表に際しては、個人の特定が可能な情報はすべて削除されます。
この研究に関して、不明な点がある場合、あるいはデータの使用に同意されない場合には、以下にご連絡頂きたいと思います。なお、本研究は、東京大学医学部倫理委員会の承認を得ております。

この研究への参加をお断りになった場合にも、将来的に当科における診療・治療の面で不利益をこうむることはありませんので、ご安心ください。
 

平成 25年 3月 29日
連絡先 東京大学医学部附属病院 消化器内科 山道信毅
住所:113-8655  東京都文京区本郷7-3-1
電話:03-3815-5411(内線 36818)
 

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